Objetivos
· Ilustrar los principios prácticos de una técnica de uso frecuente para la investigación de laboratorios especializados de análisis.
· Preparar el gel de poliacrilamida.
· Determinar el peso molecular de una proteína mediante la técnica de electroforesis.
Resumen
Marco Teórico
Electroforesis
Electroforesis es la migración de moléculas cargadas en solución como respuesta a la presencia de un campo eléctrico. La velocidad de migración depende principalmente de la fuerza del campo, de la carga, forma, masa y tamaño de la molécula, así como de la fuerza iónica, viscosidad y temperatura del medio en el que las moléculas se estén moviendo. Como herramienta analítica, la electroforesis es rápida, sensible y simple. La electroforesis es ampliamente usada para estudiar propiedades de especies cargadas en solución, y como una técnica de separación.
Matrices de soporte
Generalmente la muestra es corrida en matrices como papel, acetato de celulosa, geles de almidón, agarosa ó poliacrilamida. La matriz inhibe la difusión osmótica, así como el mezclado producido por convección térmica., además provee un registro del proceso electroforético ya que puede marcarse y usarse para mediciones, autoradiografía ó almacenamiento. Las matrices de soporte más ampliamente usadas (agarosa y poliacrilamida) proveen además, un medio para separar moléculas por tamaño, ya que son geles porosos y pueden actuar como tamices moleculares.
Separación de proteínas
Las proteínas son compuestos anfotéricos, por lo tanto su carga neta está determinada por el pH del medio en el que están suspendidas. En una solución con un pH por encima de su punto isoeléctrico, una proteína tiene una carga neta negativa y en un campo eléctrico migra hacia el ánodo, mientras que migrará hacia el cátodo a pHs por debajo de su punto isoeléctrico. La carga presente en una proteína es independiente de su tamaño y varía de una proteína a otra, por lo tanto, la separación electroforética de proteínas bajo condiciones no desnaturalizantes se realiza en virtud de su carga y tamaño.
Separación de proteínas bajo condiciones desnaturalizantes
El dodecil sulfato de sodio (SDS) es un detergente aniónico que desnaturaliza proteínas “envolviendo” el esqueleto polipeptídico, la unión presenta una relación de masas 1,4:1. El SDS confiere carga negativa al polipéptido en relación a su longitud. Usualmente es necesario reducir los puentes disulfuro de las proteínas para permitir la unión cuantitativa del SDS, esto se lleva a cabo en caliente con 2-mercaptoetanol. En SDS-PAGE, la migración no es determinada por la carga eléctrica del polipéptido, sino por su peso molecular.
Sistemas de amortiguadores continuos y discontinuos
Un sistema continuo tiene un gel de separación sencillo y usa el mismo amortiguador en los tanques y en el gel, en un sistema discontinuo, un gel de poro grande y no restrictivo, llamado gel de apiñamiento, es colocado en la parte superior del gel de separación, llamado gel de resolución. Cada gel está hecho con un amortiguador diferente, y el amortiguador de los tanques es diferente al de los geles. La mayor ventaja de los sistemas de amortiguador discontinuos sobre los continuos es que pueden agregarse volúmenes relativamente grandes de muestras de proteína diluída a los geles sin comprometer la resolución, esto se debe a que las proteínas son concentradas en zonas extremadamente estrechas durante su migración en el gel de apiñamiento. La resolución alcanzada con un sistema discontinuo es muy superior a la obtenida con sistema continuo.
La justificación teórica de proceso electroforético en los sistemas discontinuos será discutida en la sesión de laboratorio.
Geles de poliacrilamida
Los geles de poliacrilamida se obtiene polimerizando monómeros de acrilamida (CH2=CHCONH2) en cadenas largas y entrecruzándolas con un compuesto bifuncional como N,N’-metilenbisacrilamida ( CH2(NHCOCH=CH2)2, usualmente llamada bisacrilamida). La polimerización es iniciada mediante la adición de persulfato de amonio ó riboflavina, y se usa N,N,N’,N’-tetrametilenetilendiamina (TEMED) como acelerador del proceso de polimerización. Ambos iniciadores de polimerización generan radicales libres, el persulfato de amonio espontáneamente en solución (enlace peróxido), y la riboflavina mediante fotodescomposicion.
El tamaño de poro efectivo de los geles de poliacrilamida depende inversamente de la concentración de acrilamida, y se usan geles con concentraciones de acrilamida desde 2.5% (moléculas con peso mayor de 106) hasta 30% (polipéptidos con peso de ~2000). Para una concentración de monómero dada, las propiedades del gel varían con la proporción de agente entrecruzador usado, al aumentar éste el tamaño de poro decrece, alcanzando un mínimo cuando representa un 5% de la cantidad total de monómero.
pH
Los límites prácticos de pH para realizar PAGE están entre pH 3 y 10, ya que algunas reacciones hidrolíticas (como desaminación) ocurren a pHs extremos. La elección del pH para PAGE depende de dos consideraciones opuestas, a pHs cercanos al punto isoeléctrico de las proteínas a separar, la diferencia de carga entre ellas es grande, aumentando la posibilidad de separación, sin embargo, al ser pequeña la carga, los tiempos de corrido son largos, llevando a un aumento en el ensanchamiento de banda. En SDS-PAGE los complejos polipéptido-SDS están negativamente cargados en un rango amplio de pH, por lo tanto el pH no es crítico.
Marcaje de las bandas
Las bandas pueden ser evidenciadas mediante diferentes métodos como tinción con colorantes, revelado “fotográfico”, autorradiografía ó con marcaje fluorescente. En la presente aplicación se usará marcaje con plata, método altamente sensible y rápido. Las bandas de proteína son fijadas en la posición final después de la electroforesis precipitando las proteínas con metanol y ácido acético, las bandas son sensibilizadas con tiosulfato de sodio, que mejora el contraste entre las bandas teñidas y el fondo del gel, posteriormente el gel se trata con nitrato de plata, los iones plata se complejan con la proteína, y en un paso posterior, similar al revelado fotográfico, los iones plata complejados sufren una reducción mucho más rápida que los iones plata libres, formando partículas coloidales de plata en las dos superficies del gel, preferencialmente sobre las bandas de proteína, haciéndolas visibles. Los límites de detección son del orden de proteína.
Electroforesis de proteínas del suero humano
Las proteínas presentes en el suero humano pueden agruparse en 4 fracciones dependiendo de su movilidad electroforética: Albúminas, alpha, beta y gamma globulinas. La mayoría de las alpha y beta globulinas son sintetizados en el hígado, mientras que las gamma globulinas son producidas por linfocitos y células plasmáticas.
Las albúminas del suero pertenecen a una familia multigénica de proteínas que conforman la mayor fracción de proteínas solubles en el sistema circulatorio, estas desempeñan diversas funciones fisiológicas, como regulación de la presión osmótica, transporte y distribución de un gran número de ligandos endógenos y exógenos que incluyen ácidos grasos, aminoácidos, esteroides, metales como calcio, cobre y zinc y fármacos. Las alpha1 globulinas incluyen a-1-antitripsina, a-1-antiquimotripsina y a-1-lipoproteína (LDH), entre otras. Entre las alpha2 globulinas están la a-2-macroglobulina (inhibidor de proteasas), haptoglobulina (se une a hemoglobina libre), proteína C (inhibidor de factores de coagulación), ceruloplasmina (transportador de cobre) y a-2-lipoproteína (VLDL). Las beta1 globulinas incluyen transferrina(capta hierro) y hemopexina. Las beta2 globulinas incluyen plasminógeno, b-2-lipoproteína (LDL) y alguna proporción de IgA. El fibrinógeno también migra en esta región. Las gamma globulinas consisten en las inmunoglobulinas IgM, IgA e IgG.
La electroforesis es usada para separar las globulinas de las albúminas, ya que los niveles de cada fracción son de importancia en diagnóstico clínico. La muestra preferida es el suero, ya que el fibrinógeno contenido en el plasma a menudo obscurece cambios en los niveles de las beta y gamma globulinas. Otras muestras usadas son el fluido peritoneal u orina.
Mediante la electroforesis pueden separarse y cuantificarse unas 100 proteínas presentes en el suero, los niveles obtenidos son útiles para diagnosticar gamopatías monoclonales (asociadas al cáncer), cirrosis, hepatitis autoinmune, artritis reumática, osteomielitis, bronquitis, leishmaniosis, lepra, leucemia, enfermedades inmunológicas, SIDA, mielomas , desórdenes renales, carcinomas, infecciones agudas, diabetes, embarazo, estrés, daño celular y desnutrición entre otros estados clínicos.
Materiales
· Cámara de electroforesis
· Fuente de voltaje
· Enfriador a 4°C
Reactivos
· Solución stock monómero (Acrilamida 29,2%, bisacrilamida 0,8%)
· Amortiguador Tris-HCl 1,5M pH 8,8
· Amortiguador Tris-HCl 0,5M pH 6,8
· Amortiguador Trisbase-glicina pH 8,3 (5X)
· Solución stock SDS 10%
· Persulfato de amonio al 10% (recién preparado)
TEMED
· Amortiguador reductor para las muestras : SDS 2-mercaptoetanol
Glicerol
· Azul de bromofenol
Amortiguador pH 6,8
· Fijador A (Metanol 50%, ácido acético 5%)
· Fijador B (Metanol 50%)
· Sensibilizador (Tiosulfato de sodio 0,02%)
· Marcador (Nitrato de plata 0,1%)
· Revelador (Formaldehído 0,04%, carbonato de sodio 2%)
· Enjuage (Acido acético 5%)
Agua desionizada
Esquema Experimental
